色五月 【突变体and缺失体】质粒构建protocol🌟
发布日期：2024-09-14 09:23 点击次数：133
对于WT质粒构建，酶切法和同源重组法之前齐共享过，今天写了下对于突变体和缺失体质粒构建的protocol，主淌若引物贪图和载体遴荐的问题❗️
✅贪图引物：
1、 当先要保证已有WT plasmid。教程在图2图3，引物贪图之后pcr概况3～5小时，看载体长度，然后等于DpnI酶消化，紧接着等于重组响应，感受态滚动了，缺失体和突变体齐可以用色五月，贪图引物有相似之处色五月，这种才智所以通盘这个词质粒为模版的色五月，选用的酶也齐是高高高保真酶。
2、 肖似于同源重组响应，以突变体为中心，遴荐突变氨基酸的前8个碱基，和突变氨基酸的后20个碱基，再加上突变后的氨基酸（3个碱基），这等于引物的构成。
✅载体的遴荐：
1、作念瞬转就WT，突变体齐用平素载体即可，概况4000～5000bp傍边，作念稳转可用慢病毒载体，大小不等，基本齐大于9000bp，团结个基因的WT，突变体，缺失体，截断体齐要用团结类型载体，最佳不要更换。
2、保证质粒载体莫得问题，无论是各式载体元件已经载体抒发才智。
3、要用抒发相对褂讪的载体，卵白抒发才智和载体关系很大，见过用着用着就不抒发了的质粒，可能等于载体自己不能，这种径直pass。👾
4、作念突变体和截断体尽可能作念到质粒抒发才智一致，保举寰宇使用云舟生物家的【VectorBuilder】去看载体相干信息，他们家的慢病毒载体就挺可以的！
5、【VectorBuilder】载体家可以径直用手机干与官网，也可以用电脑，载体种类好多，说明我方需求遴荐，举例：哺乳动物基因抒发载体，这里又分为好几大类，慢病毒载体等…除此以外还有果蝇，线虫…
6、如果需要修改元件，点击VectorBuilder里的贪图载体即可我方贪图，贪图经由中会自动领导是否正确，除此以外也有涵养视频可以看～‼️
7、和平素其他有质粒合成的不太相同的点是：
他们基本惟有几种况且我方无法修改或者贪图，云舟生物家的载体可以我方贪图，贪图好之后下单即可，不下单的话我方贪图的载体序列也可以文献口头导出，用别的ap*也能开放，有需要的宝可以去遴荐～❗️
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